Biología (08) · Unidad 1 — La célula y cómo se estudia
El microscopio óptico: aumento y límite de resolución
Un microscopio hace dos cosas distintas: agranda la imagen (aumento) y separa detalles que están muy juntos (resolución). El aumento total es ocular × objetivo; el límite de resolución del microscopio óptico es de unos 0,2 µm, y agrandar más no muestra nada nuevo.
La explicación
El problema: agrandar no alcanza
Si sacás una foto chiquita de un diario con el celular y la agrandás mucho en la pantalla, llega un punto en que no ves más letras: ves cuadraditos borrosos. La foto está más grande, pero no tiene más detalle. Con el microscopio pasa lo mismo, y por eso hay que separar dos ideas.
Aumento
El aumento es cuántas veces más grande se ve la imagen que el objeto. El microscopio óptico compuesto tiene dos juegos de lentes en serie: el objetivo, cerca de la muestra, y el ocular, donde se apoya el ojo. Cada uno agranda, y el segundo agranda la imagen que ya agrandó el primero, así que los aumentos se multiplican:
Ocular 10× con objetivo 40×: 10 × 40 = 400×.
Los objetivos habituales son 4×, 10×, 40× y 100× (este último, de inmersión en aceite). Los oculares, 10× o 15×.
Al aumentar, el campo (el círculo que se ve) cubre una porción más chica de la muestra: si el aumento se multiplica por 4, el diámetro del campo se divide por 4.
Tamaño real a partir de una imagen
En una foto tomada con el microscopio, cada objeto aparece agrandado tantas veces como el aumento. Para volver al tamaño real se divide:
Una célula que en una foto a 1000× mide 2 cm: 2 cm = 20 mm = 20 000 µm; 20 000 µm / 1000 = 20 µm.
Cómo se resuelve: 1) pasá la medida de la foto a µm (o a nm si el objeto es muy chico); 2) dividí por el aumento; 3) controlá que el resultado tenga sentido (una célula de 20 m o de 0,002 nm delata un error de unidades).
Límite de resolución
El límite de resolución (LR) es la menor distancia entre dos puntos a la que todavía se los ve como dos puntos separados. Si están más cerca, se ven como una sola mancha, por más que se agrande. Cuanto más chico el LR, mejor el instrumento; el poder de resolución es la capacidad de separar detalles, y es mejor cuanto menor sea el LR.
Microscopio óptico: unos 0,2 µm (200 nm), mil veces mejor que el ojo.
Microscopio electrónico: en las mejores condiciones, unos 0,1 a 0,2 nm; con muestras biológicas, en la práctica, alrededor de 1 a 2 nm.
El LR del microscopio óptico no depende del aumento sino de la luz y del objetivo:
λ es la longitud de onda de la luz (la luz visible va de unos 400 nm, violeta, a unos 700 nm, rojo).
AN es la apertura numérica del objetivo, que viene grabada en él: cuánta luz recoge. En seco no pasa de 0,95; con aceite de inmersión entre el objetivo y el preparado llega a 1,4: el aceite tiene un índice de refracción parecido al del vidrio, así que los rayos inclinados no se desvían ni se pierden al salir del preparado, y entran al objetivo.
Con λ = 400 nm y AN = 1,22: LR = 0,61 × 400 / 1,22 = 200 nm.
Por eso lo que se ve con el óptico: células, núcleos, bacterias, cloroplastos, mitocondrias (apenas, como puntitos o bastoncitos). Lo que no: virus (salvo los gigantes), ribosomas, el espesor de la membrana, las proteínas. Agrandar más allá de unas 1000 veces la apertura numérica es aumento vacío: la imagen crece, borrosa, sin detalle nuevo.
1. Pasá el tamaño del objeto (o la distancia entre los detalles) a nm.
2. Compará con el LR: si es mayor que unos 200 nm, el óptico lo resuelve; si es menor, hace falta el electrónico.
Luz blanca, luz fluorescente y tipos de microscopio óptico
La luz blanca es la mezcla de todas las longitudes de onda visibles. La fluorescencia es otra cosa: ciertas moléculas (fluorocromos) absorben luz de longitud de onda corta, como la ultravioleta o la azul, y emiten luz de longitud de onda más larga, por ejemplo verde. Si se pega un fluorocromo a una proteína, la proteína «se enciende» sobre fondo negro.
De contraste de fases: convierte las pequeñas diferencias en cómo la luz atraviesa cada parte en diferencias de brillo. Permite ver células vivas sin teñir.
De campo oscuro: la muestra brilla sobre fondo negro; sirve para objetos chicos y vivos, como bacterias que nadan.
De fluorescencia (y el confocal, que hace cortes ópticos nítidos): muestra dónde está una molécula marcada; se puede usar con células vivas.
Con un microscopio que tiene ocular de 10× y objetivo de 40×, se fotografía un glóbulo rojo y en la foto mide 3 mm. a) ¿Con qué aumento se tomó la foto? b) ¿Cuánto mide en realidad el glóbulo? c) Si se cambia al objetivo de 100× con aceite de inmersión (AN 1,25) y se ilumina con luz verde de 550 nm, ¿cuál es el límite de resolución? d) ¿Se podría ver con ese microscopio un virus de 100 nm?
b) Tamaño real: 3 mm = 3000 µm; 3000 µm / 400 = 7,5 µm. Es lo que mide un glóbulo rojo: el resultado tiene sentido.
c) Límite de resolución: LR = 0,61 × 550 nm / 1,25 = 268 nm (unos 0,27 µm).
d) El virus: 100 nm es menos que 268 nm. No se resuelve: con suerte se vería un punto de luz difuso, sin forma. Hace falta un microscopio electrónico.
Fijate en el c: para calcular el LR no se usa el aumento. El aumento cambió (ahora es 1000×) pero el LR depende sólo de λ y de la AN. Con más aumento, el glóbulo se ve más grande; con mejor AN, se ve más nítido.
Dónde se pierde el punto: en el b, dividiendo 3 por 400 sin convertir (da 0,0075, que serían milímetros, no micrómetros); y en el d, creyendo que si se agranda lo suficiente cualquier cosa se ve.
Un estudiante quiere ver ribosomas y, como con 1000× no los ve, propone sacarle una foto a la imagen y ampliarla diez veces en la computadora. ¿Va a verlos? ¿Qué le recomendarías?
No va a verlos. Un ribosoma mide unos 25 nm, y el límite de resolución del microscopio óptico ronda los 200 nm. Dos ribosomas a 50 nm de distancia caen dentro de la misma «mancha» de luz: la imagen ya no tiene esa información.
Cambiar a luz azul o aceite de inmersión mejora un poco el LR, pero no lo baja de 25 nm: no alcanza ni de cerca.
Lo que sí sirve es un microscopio electrónico de transmisión, cuyo límite práctico con muestras biológicas es de 1 a 2 nm. Con él, los ribosomas se ven como granitos oscuros, sueltos o pegados al retículo.
Dónde se pierde el punto: en hablar sólo del aumento. La respuesta tiene que nombrar el límite de resolución y comparar números.
Dónde se cae la mayoría
- Sumar los aumentos en vez de multiplicarlos: 10× y 40× dan 400×, no 50×.
- Creer que con más aumento siempre se ve más detalle. Lo que decide el detalle es el límite de resolución.
- Confundir límite de resolución con poder de resolución: cuanto menor el límite, mayor el poder.
- Dividir el tamaño de la foto por el aumento sin pasar antes a la misma unidad.
- Pensar que la fluorescencia es luz blanca más fuerte. Es luz que la molécula emite, de otro color que la que absorbió.
Hasta acá la explicación. La práctica es la otra mitad: 7 ejercicios de este tema, en cuatro niveles, que no te dicen sólo si está bien al final sino que te corrigen en cada paso y te explican por qué. Además trae una animación que muestra la idea en movimiento y un simulador donde los números los elegís vos.
Practicar El microscopio óptico: aumento y límite de resolución →Dónde entra este tema en el parcial
- Primer parcial — El yogur bajo el microscopio15 puntos · resuelto paso a paso
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