Biología (08) · Unidad 1 — La célula y cómo se estudia
Microscopio electrónico, histoquímica y fraccionamiento celular
Para ver lo que el óptico no resuelve se usan electrones: el microscopio de transmisión muestra el interior en cortes finísimos y el de barrido, la superficie. Para saber de qué está hecha cada parte, se tiñe con reactivos específicos (histoquímica) o se rompe la célula y se separan sus organelas centrifugando.
La explicación
El problema: ver más chico y saber de qué está hecho
Con el microscopio óptico se ve el núcleo, pero no los ribosomas ni el espesor de una membrana. Y aunque se viera todo, quedaría otra pregunta: ¿qué hace cada parte, y de qué está hecha? Para eso hay tres familias de técnicas: ver con electrones, teñir con química y separar las piezas.
El microscopio electrónico
El límite de resolución depende de la longitud de onda (tema 1.3). Los electrones acelerados se comportan como una onda de longitud muchísimo más corta que la luz, así que el límite baja a unos pocos nanómetros con muestras biológicas. En vez de lentes de vidrio usa electroimanes que desvían el haz, y todo funciona en vacío, porque el aire frenaría los electrones. Por eso no se pueden observar células vivas.
De barrido (MEB): un haz recorre la superficie de una muestra recubierta con una capa de metal. Da imágenes con aspecto de relieve: la superficie de un espermatozoide, los pelos de una hoja, una bacteria sobre un tejido. Su resolución es algo menor que la del de transmisión.
Las imágenes de electrones son en blanco y negro: los colores de las fotos de libros se agregan después, para que se entiendan.
La técnica histológica
Para mirar un tejido con el microscopio óptico hay que convertirlo en una lámina fina, transparente y con contraste. Los pasos:
2. Inclusión en parafina: endurece el tejido para poder cortarlo.
3. Corte con un micrótomo, en láminas de unos 5 a 10 µm.
4. Coloración: la más común es hematoxilina y eosina.
5. Montaje entre portaobjetos y cubreobjetos.
La hematoxilina se comporta como un colorante básico: se une a lo ácido, como el ADN y el ARN, y tiñe de violeta el núcleo (se dice que es basófilo). La eosina es un colorante ácido: se une a las proteínas básicas del citoplasma y lo tiñe de rosa (acidófilo).
Histoquímica: teñir sabiendo qué se tiñe
La histoquímica usa reacciones químicas específicas para mostrar dónde está una sustancia dentro de las células, sin sacarla de su lugar.
Feulgen: tiñe específicamente el ADN; sirve para ver dónde está y comparar cuánto hay.
Sudán: tiñe los lípidos. Se usa sobre cortes congelados, porque la inclusión en parafina usa solventes que disuelven las grasas.
Anticuerpos marcados (inmunocitoquímica): un anticuerpo que reconoce una sola proteína, unido a un fluorocromo, muestra dónde está esa proteína.
1. ¿Querés saber dónde está una sustancia en la célula intacta? Histoquímica.
2. ¿Querés separar una organela para estudiarla aparte? Fraccionamiento.
3. ¿Querés ver su forma por dentro con detalle de nanómetros? MET. ¿Su superficie? MEB.
Fraccionamiento celular
Para estudiar qué hace una organela hay que tenerla sola, en un tubo. Primero se homogeneiza el tejido: se rompen las células en un medio frío e isotónico (por ejemplo, sacarosa), para que las organelas no se hinchen ni revienten por ósmosis. Después viene la centrifugación diferencial: se centrifuga a velocidades cada vez mayores y, en cada vuelta, se separa el sedimento (pellet) y se vuelve a centrifugar el líquido de arriba (sobrenadante).
Lo más grande y pesado cae primero, con poca fuerza; lo más chico necesita fuerzas enormes durante más tiempo. El orden es siempre el mismo (los valores son orientativos):
2. A velocidad media (del orden de 10 000 a 20 000 g): mitocondrias, lisosomas y peroxisomas (y cloroplastos, si es tejido vegetal).
3. A alta velocidad (del orden de 100 000 g, una hora): microsomas, vesículas que se forman al romperse el retículo endoplásmico y otras membranas.
4. A velocidad muy alta, durante horas: ribosomas libres y macromoléculas grandes.
Lo que queda arriba al final es el citosol.
Los microsomas no existen como tales en la célula viva: son pedacitos de membrana que se cierran solos al romperse el retículo. Para separar partículas de tamaño parecido y distinta densidad se usa además la centrifugación en gradiente de densidad.
Cultivo de células
Se pueden hacer crecer células fuera del organismo, en un medio estéril con nutrientes y a la temperatura del cuerpo. Sirve para estudiar un solo tipo celular sin la interferencia del resto, probar el efecto de un fármaco, multiplicar virus (que sólo crecen dentro de células) y producir vacunas.
En un laboratorio quieren estudiar las enzimas de las mitocondrias del hígado de rata. a) ¿En qué medio rompen las células, y por qué? b) Al centrifugar el homogenizado a baja velocidad, ¿qué queda en el sedimento? c) ¿En qué paso quedan las mitocondrias, y qué otras organelas caen con ellas? d) Para controlar que la fracción tiene mitocondrias enteras, la miran con un microscopio electrónico de transmisión: en la foto, a 40 000×, una mitocondria mide 20 mm de ancho. ¿Cuánto mide en realidad?
b) A baja velocidad sedimentan los núcleos (y las células que no se rompieron). Ese sedimento se descarta y se sigue con el sobrenadante.
c) En la segunda centrifugación, a velocidad media. Con ellas caen lisosomas y peroxisomas, que tienen tamaño parecido. Para separarlos se puede hacer después un gradiente de densidad.
d) 20 mm = 20 000 000 nm; 20 000 000 nm / 40 000 = 500 nm = 0,5 µm.
Control del d: medio micrómetro de ancho es lo que mide una mitocondria. Si hubiera dado 500 µm, sería más grande que la célula entera: error de unidades.
Dónde se pierde el punto: en el c, contestando que las mitocondrias caen solas. En la misma fracción hay otras organelas de tamaño parecido, y eso importa cuando se mide una enzima: hay que saber de quién es.
Una investigadora quiere saber si una célula de páncreas guarda una proteína en vesículas cerca de la membrana. Tiene un anticuerpo que reconoce esa proteína. ¿Qué técnicas usaría, y qué le aporta cada una?
No hay una sola técnica que responda todo: conviene combinarlas.
Microscopio electrónico de transmisión con anticuerpos unidos a partículas de oro: el oro frena los electrones y se ve como puntos negros. Confirma que la proteína está adentro de vesículas y no suelta, con resolución de nanómetros.
Fraccionamiento: si separa las vesículas por centrifugación y mide la proteína en cada fracción, confirma que está en la fracción de vesículas y cuánta hay.
Lo que no le sirve: el microscopio de barrido, que sólo ve la superficie de la célula; y una tinción común de hematoxilina y eosina, que no distingue una proteína de otra.
Dónde se pierde el punto: en elegir una técnica sin decir qué pregunta contesta. La lógica es: dónde (histoquímica), con cuánto detalle (MET), cuánto y en qué fracción (fraccionamiento).
Dónde se cae la mayoría
- Creer que el microscopio electrónico puede mirar células vivas. Trabaja en vacío y con muestras fijadas.
- Confundir transmisión con barrido: el de transmisión muestra el interior en cortes; el de barrido, la superficie.
- Invertir el orden del fraccionamiento: lo más grande sedimenta primero, a menor velocidad.
- Pensar que los microsomas son una organela. Son vesículas que se forman al romper el retículo.
- Homogeneizar en agua pura: las organelas se hinchan y revientan por ósmosis. El medio tiene que ser isotónico.
Hasta acá la explicación. La práctica es la otra mitad: 7 ejercicios de este tema, en cuatro niveles, que no te dicen sólo si está bien al final sino que te corrigen en cada paso y te explican por qué. Además trae una animación que muestra la idea en movimiento.
Practicar Microscopio electrónico, histoquímica y fraccionamiento celular →Dónde entra este tema en el parcial
- Primer parcial — El yogur bajo el microscopio15 puntos · resuelto paso a paso
Los otros temas de la unidad 1
La célula y cómo se estudia